實時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術(shù)服務(wù)
實時熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的 mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。
SYBR Green熒光染料法
SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。
它的大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。
要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。
TaqMan熒光探針法
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。
即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
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